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TRzol LS(液体样本 RNA 提取试剂)

简要描述:

TRzol LS(液体样本 RNA 提取试剂)公司正在出售的·百家乐·产品:新生隐球菌基因组DNAA431(A-431)人表皮癌细胞6磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)测试盒(比色法)牙龈卟啉单胞菌基因组DNAA498人肾癌细胞肌酸激酶(CK)测试盒(比色法)荧光假单胞菌基因组DNAA549 人肺癌细胞 硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)测试盒(比色法)詹氏乳酸杆菌基因组DNAA549+RF

更新时间:2024-01-12

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商品属性:

·百家乐·产品名称

规格货号
TRzol LS(液体样本 RNA 提取试剂)50ml×2A-Hc2003

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储存条件:

TRzol LS 在室温下能稳定保存 12 个月。尽管如此,为达到最佳效果,·百家乐·建议保存在 2-8°C 的环境下。

重要提示:

有毒物接触皮肤或者不慎吞服,会导致灼伤。一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适,看医生并寻求和其他成分的正确治疗方案。

·百家乐·产品介绍:

TRzol LS试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层、中间层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来回收。无论是人、动物、植物还是细菌,该方法对少量及大量的组织和细胞均有较好的分离效果。TRzol LS 试剂操作上的简单性允许同

时处理多个样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRzol 抽提的总 RNA 能够避免DNA 和蛋白的污染,可用于 RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+筛选、体外翻译、RNA 酶保护分析和分子克隆。如果是用于 PCR,当两条引物位于单一外显子内时,建议用扩增级的DNase I 来处理抽提的总RNA。

注意事项:

1.从少量的组织(1~10mg)或细胞(10 2-10 4 个)中分离RNA 样品:往组织或细胞中加 入 800µl TRzol。待样品裂解后,加入氯仿并进行步骤 2 中的抽提操作。在用异丙醇沉 淀 RNA 之前,加入 5~10μg 无 RNA 酶的glycogen 作为水样层的载体。为降低其黏度 在加入氯仿前用 26 号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。Glycogen 会留在水样层中 并和 RNA 共析出。在浓缩到 4mg/ml 之前它不会抑制逆转录反应第一链的合成也不会 抑制 PCR。

2.在匀浆化后和加入氯仿之前,样品可以在-60℃或者-70℃保存至少一个月。将 RNA 沉淀溶于 75%的乙醇在 2-8℃至少可以保存一周,在-5—-20℃下至少可保存一年。

3.用 TRzol LS 抽提 RNA 时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通 风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外,室温保持在 15~30℃的条件下。

自备试剂:

氯仿 、 异丙醇、75%乙醇(RNase-Free water 配制)、RNase-Free water(将水加入 无 RNA 酶的玻璃瓶中,加入 DEPC 至 0.1% (V/V)。放置过夜并高压灭菌)。0.5% SDS 溶液(RNase-Free water 配制)(可选)。

操作步骤:

1.样品预处理 a.生物液体 每0.25ml液体样品(血清,血浆等等)加入0.75ml TRzol LS,用加样枪吹打液体样品 几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×10 6个细胞至少加入0.75ml TRzol LS。对于含有高 污染物样品如全血样品,可以用灭菌水按照1:1比例稀释一倍后开始提取。TRzol LS 和液体样品的终体积比总是3:1。 b.组织 用glass或强力匀浆器搅匀组织样品,每50~100mg组织或者0.25ml组织悬液加 0.75ml的TRzol LS。一般50~100mg组织体积都要小于0.25ml,如果组织样品的体积小 于0.25ml,加入灭菌水将组织样品体积调整到0.25ml以保证体积比例是3:1。 c.单层生长的细胞 直接往直径3.5 cm的培养板中加入0.3ml-0.4ml的TRzol LS溶解细胞,用加样枪吹打 帮助充分裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRzol LS 量 (每10cm2加0.3-0.4ml)。不需要往裂解物里面加水,因为培养板中附着残留的培养液 已经充分稀释了TRzol LS 。 d.悬浮生长的细胞 通过离心来沉淀细胞。在TRzol LS试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每 5~10×10 6的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×10 7细菌加0.75ml的TRzol LS。和步骤 b 一样用灭菌水调节样品体积到0.25ml。在加入TRzol LS前应避免洗涤细胞,因为那 样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。 2.分离阶段 将匀浆样品在15-30°C条件下孵育5min以使核蛋白体分解。每0.75ml TRzol LS 加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2~15 min。 在2~8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15 min。离心后混合物分成三层: 下层-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。 水样层的容量大约为所加TRzol LS 容量的70%。

2.RNA 的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中,如果希望分离DNA和蛋白,有机层和中间层同 样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。每0.75ml TRzol LS对应0.5ml 异丙醇。将混合的样品在15-30°C条件下孵育10min并在2~8°C下以不超过12,000×g的离 心力高速冷冻离心10 min。RNA沉淀在离心前通常不可见,离心后会形成一胶状片状 沉淀附着于试管壁和管底。

3.RNA 的漂洗 移去上层悬液。用75%的乙醇(RNase-Free water配制)洗涤RNA沉淀一次,每0.75ml 的TRzol LS至少加1ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2~8°C下以不超过7,500×g的 离心力高速冷冻离心5 min。

4.RNA 的再溶解 室温简单干燥 RNA 沉淀,不要在真空管里离心干燥 RNA。尤为重要的是,不能让 RNA 沉淀干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 样品其 OD260 /OD280 比值<1.6 。用移液管分几次移取 RNase-Free water 或 0.5%SDS 溶液 (RNase-Free water 配制)来溶解RNA(如果RNA 以后要用于酶切反应时,避免使用SDS。) RNA 还能被 100%甲酰胺(除去离子)再溶解并保存在-70°C。

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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

公司正在出售的·百家乐·产品:

沃氏葡萄球菌基因组DNA5637人膀胱癌细胞辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒(比色法)
无乳链球菌基因组DNA8305C人甲状腺癌细胞8305C(未分化)NAD激酶(NADK)测试盒(比色法)
人葡萄球菌基因组DNA143B 人骨肉瘤细胞乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(比色法)
鲍曼不动杆菌基因组DNA22RV1人前列腺癌细胞NAD苹果酸脱氢酶(NADMDH)测试盒(比色法)
鲍氏志贺氏菌基因组DNA293FT人胚肾细胞NADP苹果酸脱氢酶(NADPMDH)测试盒(比色法)
头葡萄球菌基因组DNA293T人胚肾细胞线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH辅酶Q还原酶测试盒(比色法)
近平滑假丝酵母基因组DNA5-8F人高转移鼻咽癌细胞系NADH氧化酶(NOX)测试盒(比色法)
单核增生李斯特菌基因组DNA769-P人肾细胞腺癌细胞柠檬酸合酶(CS)测试盒(比色法)
需血斯尼思氏菌基因组DNA786-O[786-0]人肾透明细胞腺癌细胞乙醇含量测试盒(比色法)
双路普雷沃氏菌基因组DNA95-D人高转移肺癌细胞 乙醇脱氢酶(ADH)测试盒(比色法)
阴道范妮黑塞氏菌基因组DNAA172人胶质母细胞瘤细胞甲醛脱氢酶(FDH)测试盒(比色法)
副流感嗜血杆菌基因组DNAA-204人横纹肌肉瘤细胞乙醛脱氢酶(ALDH)测试盒(比色法)
格氏李斯特氏菌基因组DNAA2058人黑色素瘤细胞辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒(比色法)
阴道加德纳氏菌基因组DNAA2780人卵巢癌细胞NADP磷酸酶(NADPase)测试盒(比色法)
巴西曲霉基因组DNAA2780+GFP人卵巢癌细胞+GFP6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)/葡萄糖6磷酸脱氢酶测试盒(比色法)
光滑假丝酵母基因组DNAA3T淋巴细胞白血病细胞胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)测试盒(比色法)
化脓性链球菌基因组DNAA375人恶性黑色素瘤细胞NADP苹果酸酶(NADPME)测试盒(比色法)
百日咳鲍特菌基因组DNAA375+EGFP人恶性黑色素瘤细胞+EGFPNAD苹果酸酶(NADME)测试盒(比色法)
新生隐球菌基因组DNAA431(A-431)人表皮癌细胞6磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)测试盒(比色法)
牙龈卟啉单胞菌基因组DNAA498人肾癌细胞肌酸激酶(CK)测试盒(比色法)
荧光假单胞菌基因组DNAA549 人肺癌细胞 硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)测试盒(比色法)
詹氏乳酸杆菌基因组DNAA549+RFP 人肺癌细胞+RFP还原酶(GR)测试盒(比色法)
绿脓假单胞菌基因组DNAA549+luc 人肺癌细胞荧光素酶标记还原型(GSH)测试盒(比色法)
加氏乳杆菌基因组DNAA673人横纹肌瘤细胞氧化型(GSSG)含量测试盒(比色法)
惰性乳杆菌基因组DNAA875人黑色素瘤细胞TRzol LS(液体样本 RNA 提取试剂)肽过氧化物酶(GPX)测试盒(比色法)
卷曲乳杆菌基因组DNAAAV-293人胚肾细胞硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)测试盒(比色法)
支气管炎博德特氏菌基因组DNAAC16人心肌细胞S转移酶(GST)测试盒(比色法)






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