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RNase Away 即用型强力 RNase 灭活剂

简要描述:

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更新时间:2024-01-12

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商品属性:

·百家乐·产品名称

规格

货号

RNase Away 即用型强力 RNase 灭活剂

100ml

A-Hc2014

保存条件:室温 6 个月。

·百家乐·产品介绍:

RNaseAway 主要用来清除实验器具表面 RNA 酶。它含有数种抑制 RNA 酶成份,可以有效的清除包括操作台,玻璃表面,塑料表面等处的 RNA 酶污染。

注意事项:

1. RNaseAway 环境温度低时可能会析出浑浊或者沉淀,可在 37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。

2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化影响使用效果,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

3. RNaseAway 有腐蚀性,操作时候应该戴手套,并且避免用于某些易腐蚀的金属表面。

百家乐操作步骤:

1.塑料和玻璃容器加入足够 RNaseAway 到容器中,使所有的待处理容器表面都充分接触到 RNaseAway(可以倾斜,颠倒或者抓着容器打旋转来帮助待处理表面都接触到 RNaseAway,如果是离心管,可以涡旋振荡 1min),10min 后,弃RNaseAway,用高压灭菌水/DEPC 处理水充分淋洗后晾干(注意避免使用 RNase 污染的水淋洗或者操作不慎引

入二次污染)。

2.工作台面

直接将 RNaseAway 喷洒在工作台面并用纸巾擦拭均匀,10min 后用干净纸巾擦去表面 RNaseAway,然后用高压灭菌水淋洗后,用新的干净纸巾擦干。

3.实验设备

将 RNaseAway 小心倒在纸巾上,用润湿了 RNaseAway 的纸巾擦洗实验设备表面(小的实验设备部件可以短暂浸泡在 RNaseAway),10 min 后用干净纸巾擦去表面 RNaseAway,然后用高压灭菌水淋洗后,自然风干或者用新的干净纸巾擦干。

PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR BufferTaq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNAPCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2minPCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

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PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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