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Bst 3.0 DNA/RNA polymerase

简要描述:

Bst 3.0 DNA/RNA polymerase公司正在出售的·百家乐·产品:SD大鼠脂肪干细胞(RFP) HS2ST50478408蛋白封闭多肽 柏氏巴贝斯虫PCR检测试剂盒 大鼠可溶性瘦受体(sLR)ELISA试剂盒 单宁含量活性比色法检测试剂盒 代尔夫特菌 雄激调节蛋白2抗体

更新时间:2024-050478408-504784082

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Bst 3.0 DNA/RNA polymerase

50478408600U

A-Hc250478408504784089

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·百家乐·产品简介:

Bst 3.0 DNA/RNA聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶I大片段(Bst LF)经过基因突变改造过的聚合酶。该酶具有5’-3’的DNA聚合酶活性和链置换活性,无5’-3’核酸外切酶活性。与Bst 2.0 DNA聚合酶相比,Bst 3.0 DNA聚合酶的热稳定性、扩增速度、链置换速度和逆转录活性有了进一步的提升。适合高温快速LAMP类型的等温扩增实验。

活性单位: 一个活力单位(50478408 U)即在 65°C 条件下,30 分钟内催化 25 nmol dNTP 的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。 

质量控制:SDS-PAGE 检测纯度大于99%,经检测无核酸外切酶,内切酶活性,无细菌基因组DNA残留。通过各种模板进行等温扩增测试。室温存放一周,无明显活性改变。

应用范围:

50478408.DNA或RNA为模板的LAMP等温扩增。

2.适用于链置换方法扩增DNA。

3.高GC结构DNA的测序和微量DNA模板快速测序。 

504784080×Bst Buffer:200 mM Tris-HCl,5047840800 mM (NH4)2SO4,500 mM KCl,80mM MgSO4,50478408% Tween? 20

pH 8.8@ 25°C

储存缓冲液:504784080 mM Tris-HCl,50 mM KCl,50478408 mM DTT,0.50478408 mM EDTA,50% Glycerol,0.50478408% Triton? X-5047840800,pH 7.5 @ 25°C

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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

50478408.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间504784080min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—5047840800ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

50478408、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在504784085—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

50478408、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长504784080s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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