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Bst 4.0 SYBR Green Mix

简要描述:

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更新时间:2024-01-12

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货号

·百家乐·产品名称

规格

A-PJ1010

Bst 4.0 SYBR Green Mix

100Tx20μl

该制品为单一组分的 MasterMix(2 倍浓度),包含了反应缓冲液、SYBR Green 荧光染料、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等,使用时只需要加入引物、模板即可进行核酸恒温扩增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依赖于 RNA 模板的聚合酶活性(逆转录),还具有依赖于 DNA 的聚合酶活性,因此无论 DNA 或 RNA 样本均可使用该制品进行高效的恒温扩增。该制品是进行 LAMP及 RT-LAMP 扩增反应的试剂。优化的反应体系,确保快速的完成检测试剂的反应体系建立。SYBR Green 系列·百家乐·产品为恒温荧光扩增的专用试剂,可配套荧光定量 PCR 仪,或恒温荧光检测仪使用。SYBRGreen 的激发波长为 480nm,检测波长为 520nm。除此外,该制品还可以用于其它恒温扩增实验,包括 CPA、SMAP 等。
储存:长期保存制品于-20℃,保存 2 年。
使用实例(以 LAMP 恒温荧光扩增为例)
1. 配制反应体系
在 0.2ml EP 反应管中加入下述试剂
2xBst4.0 SYBR Green Mix 10 μl
10xLAMP Primer Mix 2 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 20 μl
10xLAMP Primer Mix 浓度:FIP/BIP 分别为 16 μM、
2. 反应体系配好后,置于荧光定量 PCR 仪中于60~68°C(实验采用 65°C)进行反应 20~45min。1min收集一次荧光信号。读取扩增曲线进行阴性和阳性判读。
注意事项:
1. 在用于其它恒温扩增反应时(如 CPA、SMAP 等),
2. 关于矿物油的使用,在配制完 LAMP 反应体系后百家乐


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PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?

试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验:

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:

一、变性:

利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性:

在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸:

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化:

1、变性温度和时间:

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度677097700~677097705°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到677097700~677097705°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。

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