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Bst 4.0 Basic Bead

简要描述:

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更新时间:2024-01-12

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商品属性:

·百家乐·产品名称

规格

货号

Bst 4.0 Basic Bead

100Tx25μl

A-PJ1009

该制品为全体系冻干微球制品,内含恒温扩增所用的反应缓冲液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等,其不包含任何染料,使用时只需要加入引物、模板即可进行核酸恒温扩增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依赖于 RNA 模板的聚合酶活性(逆转录),还具有依赖于DNA 的聚合酶活性,因此无论 DNA 或 RNA 样本均可使用该制品进行恒温扩增。该制品是进行 LAMP 及RT-LAMP 扩增反应的试剂。
本制品不包含任何显色染料,可自行搭配相关染料或检测手段进行 LAMP 反应,包括搭配 OG 染料管进行橙绿变色、搭配标记 Oligo 进行试纸条检测、搭配荧光染料进行荧光检测、搭配 Molecular Beacon 探针进行荧光检测等方法。
储存:-20℃保存 2 年;室温(25℃)保存>6 个月。
使用方法:(进行 LAMP 橙绿变色扩增):
1. 关于 OG 橙绿变色管说明:橙绿变色染料(OG Dye)以烘干的形式预加在8联管盖上。LAMP反应完毕后,将 0.2ml EP 管颠倒溶解 OG 染料后。LAMP的反应产物将与 OG 染料形成绿色肉眼可见变色反应(阳性),而未扩增的 EP 管为深橙色(阴性)。本试剂管常温长期保存。
2. 配制变色 LAMP 反应体系
在 OG 染料管(0.2ml EP)反应管中加入下述试剂
Bst4.0 Basic Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 25 μl
10xLAMP Primer Mix 浓度:FIP/BIP 分别为 16 μM、
注意:全部试剂加入完毕后,轻弹 EP 管底部后,再盖上 OG 橙
3. 反应体系配好后,置于 65°C 进行反应 15~30min。(扩增良好的引物组合,通常 20min 即可变色,一般不超过30min)。
4. 观察结果:反应结束后,从加热装置中将反应管取出,室温 2min,使整个反应管冷却下来。再次用力将反应管
注意:
(1)观察结果时,尽可能不要与配制反应空间共用,以防止污染操作台。
(2)尽管  选取的为高密封
注意事项:
(1)关于矿物油的使用,在配制完 LAMP 反应体系后,可加入一滴矿物油覆盖于反应液上部,以减少气溶胶的污
(2)在使用其它荧光染料时,使用浓度可自行优化,通染料可能导致扩增失败。
(3)本试剂不支持,浊度、pH 变色、HNB 变色反应,请勿尝试。
(4)关于 LAMP 成品试剂的建议, Bst 4.0 Basic Bead冻干球和 OG 橙绿变色管均为室温稳定状态,可长期保存。将扩增引物加入到 OG 橙绿变色管底部,于 70°C 烘干,再加入一粒冻干球即可制备成全体系检测试剂。百家乐


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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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