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RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

简要描述:

RAPA3G SYBR Green qPCR Mix公司正在出售的·百家乐·产品:结肠癌细胞 RALYL蛋白封闭多肽 牛呼吸道合胞体病毒PCR检测试剂盒 大鼠凝血子Ⅷ相关抗原(FⅧ-Ag)ELISA检测试剂盒 呤氧化(XOD)活性比色法检测试剂盒 潮汐希瓦氏菌 晚期包膜蛋白1抗体

更新时间:2024-01-12

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商品属性:

·百家乐·产品名称

规格

货号

RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

1ml

A-PJ1025

RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

5ml

A-PJ1025

百家乐

本制品是采用 SYBR Green 嵌 合 荧 光 法 进 行Real-Time PCR 的专用试剂,本 SYBR Green qPCR Mix将化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶、反应 Buffer、dNTP、SYBR Green 染料等试剂预混在一起,是一种 2×浓度的单组分预混试剂。该制品配有单独的 ROX 内参染料,可用于需要 ROX 进行孔间校正的定量 PCR 仪。RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶,其具有最高的杂质耐受性(对乙醇、胍盐、肝素具有高的耐受性),因此对于纯度较差的 DNA 模板,该 Mix 仍然可以获得理想的实验结果。RAPA3G DNA 聚合酶为化学法修饰的 HotStart版本,其在 50℃以下 100%无活性,只有 95℃条件下加热5min 后才能恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性 PCR 扩增,极大的提高了 PCR 扩增特异性。该试剂盒的反应缓冲液,可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。
包装
规 格
2×RAPA3G SYBR
Green qPCR Mix
50×ROX Dye
1ml (A2250A) 1 ml 200 μl
5ml (A2250B) 1 ml×5 200 μl
储存:
请避光置于-20℃以下可保存3年。该试剂经 30 次冻融后性能无下降,因此不使用时请置于-20℃避光保存。
操作方法
1. 根据机型选择步骤 A 或 B
A: 需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-TimePCR 仪,包括:ABI PRISM7900HT, 7300/7500/7500 FastReal-Time PCR (Applied Biosesystems);Mx3000P(Stratagene)等。按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系:终浓度
RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
注意:引物用量有时可提高到 0.8 μl 以提高扩增效率。B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-TimePCR 仪,包括:LightCycler (Roche Diagnostics); CFX96Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ);Line-Gene等。按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系:终浓度
RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法,程序如下:
 Stage 1: 95℃ 5min*
 Stage 2: 95℃ 10s
60℃ 20s 40 cycles
 Stage 3: Dissociation analysis
注意:由于该酶为化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶,必须于 95℃加热 5min 才能恢复酶的活性,该热启动步骤不能缩短时间。
3. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线、融解曲线和标准曲线。

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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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