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2XRAPA3G全能PCR Mix(with dye)

简要描述:

2XRAPA3G全能PCR Mix(with dye)公司正在出售的·百家乐·产品:中国仓鼠卵巢悬浮细胞 MSTO1蛋白封闭多肽 猪痢疾短螺旋体PCR检测试剂盒 大鼠膀胱肿瘤抗原(BTA)试剂盒 ELISA 碱性蛋白活性比色法检测试剂盒 海绵假交替单胞菌 10号染色体开放阅读框140抗体

更新时间:2024-01-12

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2XRAPA3G全能PCR Mix(with dye)

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2XRAPA3G全能PCR Mix(with dye)

1ml

A-PJ1032

2XRAPA3G全能PCR Mix(with dye)

10ml

A-PJ1032

QQ截图20240110094643.jpg

RAPA3G DNA聚合酶为经电子重构架的第三代Taq DNA聚合酶,第三代DNA聚合酶具有高度的杂质耐受性、长片段扩增能力、高扩增成功率、高产量等特征,从而使得RAPA3G系列·百家乐·产品可用于粗制样品的直接扩增,无需核酸纯化步骤。杂质耐受性方面,该酶可耐受植物中的多糖多酚;全血、血清、血浆中的肝素、高浓度的血红蛋白、甘油三脂;乙醇;胍盐;SDS等强PCR抑制剂。在血液直扩PCR实验中,RAPA3G PCR Mix性能与KAPA3G DNA聚合酶展现出同等的表现,其性能表现优于二代聚合酶(血液扩增Hemo KlenTaq Mix)。在植物直扩PCR实验中,RAPA3G PCR Mix在配合DNA释放剂的条件下与KAPA3G Plant PCR试剂盒性能一致。
长片段扩增能力方面,使用该酶可轻松扩增8kb的基因组片段,20kb的λ DNA,8kb的cDNA。该酶具有6kb/min以上的扩增速度,可显著的缩短PCR的扩增时间,在常规测试条件下,10s的延伸时间可完成1kb的基因组DNA扩增。在PCR扩增成功率方面,与其它类型的PCR扩增试剂对比中,RAPA3G PCR Mix表现出的PCR扩增成功率。此外,该酶包含一定比例的RAPA HiFi超保真DNA聚合酶,因此其具有一定的保真性能(经蓝白斑测试,其保真性能约为Taq DNA聚合酶的56倍)。另外,RAPA3G系列·百家乐·产品均采用HaiG专有的热启动技术,确保50°C以下无活性,仅有95°C加热5min以后才能恢复其活性,因此可最大限度的提高扩增的特异性,减少非特异性产物的产生。该PCR Mix具有5'-3'的聚合酶活性、5'-3'的外切酶活性和3'-5'的外切酶活性,产物部分带有"A"尾巴,部分为平末端,因此产物均可用于TA克隆或平端克隆。

特征和用途

  • 快速扩增:具有6kb/min的扩增能力,1kb片段可在25min内完成扩增.

  • 高成功率扩增:RAPA3G PCR Mix具有最高的PCR扩增成功率。

  • 液体样品直接扩增:全血、血清、培养细胞、尿液等样本直接进行PCR扩增,无需核酸纯化。

  • 组织样本直接扩增:叶片、种子、果实、动物组织等样品,可以直接扩增,也可采用DNA释放剂简单处理后直接扩增,无需核酸纯化。

  • 长片段扩增:质粒、λ DNA 等简单模板可以有效扩增>20 kb,基因组可以有效扩增>8 kb,cDNA可以有效扩增>8kb。

  • 高保真扩增:保真度是 Taq DNA Polymerase 的56 倍。

  • 高特异性:采用专有热启动技术,50°C以下无活性,仅有95°C加热5min才能恢复酶活。

RAPA3G DNA聚合酶对抑制物耐受性

SDS0.01%胍盐0.25%
乙醇5%全血15%
肝素0.1IU/ml血清15%
Trizol0.5%血浆2%
血红蛋白30μM尿液5%

50μl体积建议添加的样品量

抗凝全血2.5 μl培养细胞>100个
血清2.5 μl组织0.1mg
尿液2.5 μl毛发囊1-3个
血浆1 μlgDNA

1-400ng

植物叶片2mmcDNA1-400ng
植物粗提物2-4 μl质粒0.1-10ng

储存

长期储存置于-20°C以下,可保存2年,避免反复冻融;短期使用置于4°C(3个月)保存,一经融化后请放置于4°C,勿再冻存。

反应实例

1. 模板适应性强,长片段和短片段都可有效扩增

Lane 1:λDNA 500bp, 2:λDNA 1kb, 3:λDNA 2kb, 4:λDNA 5kb, 5:λDNA 8kb, 6:λDNA 15kb, 7:λDNA 20kb, 8:human 500bp ,9:human 1kb, 10:human 2kb ,11:human 5kb, 12:human 8kb, 13:cDNA 166bp, 14:cDNA 552bp, 15:cDNA 960bp, 16:cDNA 1574bp, 17:cDNA 1705bp, 18:cDNA 2755b,p 19:cDNA 4128bp, 20:cDNA 7600bp, M:DNA Marker 10000
选取三种DNA模板,使用RAPA3G PCR Mix进行扩增,循环数统一为28 cycles,结果如上图所示,对于不同种类DNA模板和不同长度的靶基因,RAPA3G PCR Mix均有良好的扩增性能。
2. 对于粗制样品DNA具有的耐受性



分别以人全血、血清、叶片粗制品DNA以及大豆种子粗制品DNA为模板,使用RAPA3G PCR Mix进行PCR扩增,结果如上图展示,各种粗制样品都有良好的扩增,其中全血和血清可耐受15%。

3.扩增灵敏度高,λDNA模板低至0.1pg也可以有效扩增




以λDNA为模板,选取不同模板使用量,采用RAPA3G PCR Mix进行扩增2kb靶基因,循环数统一为28 cycles,结果如上图所示,λDNA模板低至0.1pg也可以有效扩增


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PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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