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PBCV DNA连接酶

简要描述:

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更新时间:2024-01-12

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规格

A-PJ1093

PBCV DNA连接酶

1250U

A-PJ1093

PBCV DNA连接酶

5KU

描述: PBCV DNA 连 接酶 也称为 SplintR 连接酶 或 Chorella 病毒 DNA 连接酶,它能够高效催化相邻的 DNA 核苷酸的连接,这个连接过程需要一条互补的 RNA 在两条 DNA 单链间起“夹板"或“桥梁"的固定作用。PBCV DNA 连接 酶的这种活性远远优于传统的 T4 DNA 连接酶,有助于 miRNAs 和 mRNAs,包括 SNPs 在内的研究方法的创新。 另外,在二代测序和分子诊断等众多领域中,PBCV DNA 连接酶是富集目的基因的理想选择。它具有稳定的生物活 性,对 RNA 介导固定的 DNA 底物亲和性强(米氏常数 Km = 1 nM),能够在复杂的混合物中检测到亚纳摩尔级的特 定 RNA。因此,在 RNA 检测技术中,PBCV DNA 连接酶 不失为选择用酶。
储存:-20℃可保存 2 年。
10×PBCV Ligase Buffer:500 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM

MgCl2, 25 mM DTT, 5 mM ATP.
活性定义:25°C 反应 30 分钟条件下,使 1pmol 的
DNA:RNA 杂交底物连接所需要的酶量定义为 1Unit。
反应温度及失活该酶的最佳反应温度为 25°C,可在 16-37°C 之间优化,37℃可明显提高反应的特异性;该酶在 65°C 加热 20min 即可失活。
使用方法
1. 连接反应
连接底物(1 μM) 2 μl
10×PBCV Ligase Buffer 2 μl
PBCV DNA Ligase(25 U/μl) 1 μl
 灭菌水 up to 20 μl
25°C 反应 15-60min。
2. 65°C 加热 20min,使酶失活。
注意事项
1.该酶对一价阳离子非常敏感,如 NaCl 或 KCl 的浓度应低于 50 mM。
2. 该酶的反应温度为16~37°C,最佳温度为25℃。
3. 连接效率随着夹板 RNA 长度的减少而降低,当长度小于等于 10nt 时,连接效率为零。

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PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?

试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。

5.pngPCR相关基础实验:

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:

一、变性:

利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性:

在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸:

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化:

1、变性温度和时间:

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。

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