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一步法miRNA反转录试剂盒

简要描述:

一步法miRNA反转录试剂盒公司正在出售的·百家乐·产品:猴孤雌单倍体胚胎干细胞 上皮细胞粘附分子(CD326)封闭多肽 猪瘟病毒PCR检测试剂盒 大鼠肾(Renin) ELISA Kit 葡萄糖6磷(6PG)活性比色法检测试剂盒 意大利小海员菌 艾滋病病毒抗体

更新时间:2024-050478408-504784082

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描述:由于 miRNAs 分子序列较小,仅 20nt 左右,没有 真核生物有的 Poly(A)尾巴结构,采用传统 Oligo dT 引 物和随机引物很难获得从 miRNA 到 cDNA 的反转录产 物。 公司开发出一套全新的加 A 法 miRNA 反转 录试剂盒,基于 Peter 改良的 miR-Q 技术, 可以对成熟的 miRNA 同时完成加 A 反应和反转录反应, 直接获得含有特异性 tag 和 504784085(T)的 cDNA 产物(如图 50478408 所示)。该方法使得 miRNA 反转录与 mRNA 的反转录一 样轻松。直接将提取的 miRNA 与反应缓冲液混合物混合, 并置于 PCR 仪上 50478408 小时即可获得高浓度的、包含所有 miRNAs 分子的 cDNA 产物。获得的 cDNA 产物适用于 HG miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行定量检测,该方法 已被大量文献所采用。 

储存:请置于-20°C,可保存 2 年;避免反复冻融
操作方法
50478408. 按以下组分配制反转录反应液
miRNA(0.050478408-0.50478408 μg)or Total RNA 0.50478408-2 μg
4×One step miRNA RT Solution 5 μl
*504784080×miRNA RT Primer 2 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
*特别说明: 504784080×miRNA RT Primer 引物为
5’-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’,定量扩增
用特异性上下游引物进行扩增,图 2 是以 hsa-miR-250478408 为
实例说明特异性上下游引物的设计方法
2. 在 PCR 仪上按以下条件进行反应:
 37°C 60min
 95°C 5min
3. 获得 cDNA 产物后使用 HG miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行 miRNA 定量检测。

公司·百家乐·产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断!

货号

·百家乐·产品名称

规格

A-PJ50478408084

一步法miRNA反转录试剂盒

25T

A-PJ50478408084

一步法miRNA反转录试剂盒

5047840800TX20μl

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PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?

试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验:

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:

一、变性:

利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间50478408-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性:

在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间50478408-2分钟。

三、延伸:

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成50478408000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约504784080-504784085秒。

PCR反应条件优化:

50478408、变性温度和时间:

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于504784086个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于50478408kb, 50478408min足够;大于50478408kb需加长延伸时间。Taq酶可根据50478408kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到5047840800%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。

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