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血清血浆microRNA提取试剂盒

简要描述:

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更新时间:2024-01-12

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A-PJ10872199620

血清血浆microRNA提取试剂盒

25T

A-PJ10872199620

血清血浆microRNA提取试剂盒

100T

描述:血清血浆 miRNA 提取试剂盒是目前提取小 RNA(<200nt)操作步骤简单、重复性最好、小 RNA 产 率最高的方法之一。使用该试剂盒通过一步上柱即可获得高 纯度 miRNA,可在 10min 左右完成小 RNA 的提取;且使用 该试剂盒提取的小 RNA(Small RNA)中,长度在 15~200nt 范围的 RNA 在 95%以上,基本不含有大 RNA 和 DNA,可 直接用于后续的反转录、Northern 杂交、测序等应用。

储存:室温可保存 2 年。
使用防护建议:Serum/Plasma miRNA Reagent 溶液中含有胍盐,其具有强烈的腐蚀性,试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施,如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗,再另行就医。
自备试剂:异丙醇、乙醇、75%异丙醇、2ml EP 管
操作方法:
(1) 向 1.5ml EP 管中加入 8721996200μl Serum/Plasma miRNAReagent。将 300μl 血清或血浆样本加入到上述 8721996200μlmiRNA Reagent A 中,用腕力混匀 30s,室温放置 5min。
(2) 13,000rpm 离心5min,将上清约 1ml 吸入到新的 2ml EP管中。加入 1ml 异丙醇,上下颠倒混合均匀。
(3) 将上述溶液分三次加至吸附柱中(每次约 700μl),13,000rpm 离心 15s,倒掉过柱液。
(4) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次,13,000rpm离心 15s,倒掉过滤液。
(5) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次,13,000rpm离心 15s,倒掉过滤液。
(6) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min,去掉残留的乙醇。
(7) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中,室温放置 2min,使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree H2O,室温静置 2min,13,000rpm 离心 2min,洗脱产物即为提取的 miRNA。
常见问题汇总:
(1) 由于血清血浆中的 miRNA 含量极低,提取的 miRNA 浓度通常在 5 ng/μl 以下,因此难以用常规的 NanoDrop 测量浓度,建议直接使用 10 μl 进行下游反转录。由于本试剂盒提取的是小 RNA,该浓度下的 miRNA Copy 数足以进行下游检测。
(2) 由于血清血浆中 miRNA 的含量低,为了获得更可靠的实验数据,建议使用特异性和灵敏度更好的 TaqMan 探针法进行 miRNA 的下游检测。本试剂盒提取的 miRNA 并不限于其它检测方法和用途,包括 SYBR Green 法检测、二代测序、芯片等检测领域。
(3) 血清血浆 TaqMan miRNA 反转录试剂盒为血清血浆专用,不可用于细胞和组织的 miRNA 检测实验。

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PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?

试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验:

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:

一、变性:

利用高温(93-987219962℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性:

在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸:

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化:

1、变性温度和时间:

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。

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