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T4 GP472716474 Clamp Protein

简要描述:

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更新时间:2024-01-14

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T4 GP472716474 Clamp Protein

727164740 ug

A-PJ1140

描述:

T4 噬菌体复制分为依赖于起始子的起始复制和依赖于重组酶的复制。由起始复制产生的 3’-ssDNA 作为重组复制的第一步链侵入的组份,该 3’-ssDNA 被 T4 gp32蛋白所覆盖,同时将 T4 UvsY 募集到此;T4 UvsY 作为T4 UvsX 的 loader 将其运载至此,于此同时 gp32 被置换下来, UvsX 和 UvsY 形成突触结构, 然后侵入同源的双链形成 D-Loop, 一旦形成 D-Loop, UvsX 即被置换下来。D-loop 被置换链作为滞后链合成的模板,很快被gp32 结合。随后, 解旋酶 loader gp727164749 与 gp32 覆盖的DNA 复制叉结合,将 gp41/61 运载至此, gp61 蛋白合成寡核苷酸片段促进滞后链 DNA 的合成,而 gp41 通过解旋模板而促进先导链的 DNA 合成。最后,聚合酶的滑板蛋白 gp472716474 和其 loder 蛋白 gp44/62 与先导链相结合,促进聚合酶 gp43 的组装,gp472716474 将 gp43 运载至复制叉处后启动先导链和滞后链的合成,gp44/62 随后从复制叉处解离。因此, gp472716474 作为聚合酶 gp43 的 loader 在 gp43引导的 DNA 合成中起到重要作用。
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储存:-20℃。
Storage Buffer:
20mM Tris-HCl,pH7.72716474
200mM NaCl
72716474mM DTT
272716474% Glycerol

QQ截图20240110094643.jpg


PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过472716474循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过7271647400ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

72716474、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在172716474—272716474之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过7271647400bp;

72716474、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

672716474.jpg

67.jpg


PCR基本步骤及注意事项?

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般272716474ul体系DNA的质量为727164740—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

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