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2min DNA/RNA直提试剂盒

简要描述:

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更新时间:2024-01-14

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货号

·百家乐·产品名称

规格

A-PJ1171

2min DNA/RNA直提试剂盒

100T

本试剂适合从各种组织、体液中快速提取制备 PCR检测级别的基因组 DNA 和 RNA。制备的 DNA 和 RNA 可直接应用于 TaqMan PCR、One-Step PCR、LAMP、RPA 的扩增实验。该试剂制备 DNA/RNA 样品操作及其简单,通常2min 内可完成制备。
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储存: 室温保存 6 个月,若长期保存请置于-20℃(5 年)。
适用组织类型
从感染病毒的组织样本中提取病毒 DNA/RNA。
从感染细菌的组织样本中提取细菌 DNA。
从动物口腔唾液拭孖中提取病毒 DNA/RNA。
从植物组织中提取 DNA/RNA。
从血浆、血清中提取病毒 DNA/RNA
操作方法
1. 动物、植物组织中提取病毒 DNA/RNA将组织样本约 1~10 mg 放入到 1.5mL EP 管中,并加入500 μl 溶液 DNA/RNA DirOut-A,加入几粒钢珠,置于组织研磨仪中研磨 1min 左右。研磨完毕后加入 100 μl 的DNA/RNA DirOut-B 溶液,漩涡混合均匀(可短离心将未磨碎的组织去除),取 0.5 μl 的该溶液作为 DNA/RNA 模板,直接用于下游 PCR 等试验即可。注意:组织使用量不要超过 50mg,过多的组织量会抑制后续 PCR 反应。
2. 从血清、血浆、唾液等体液中提取病毒 DNA/RNA在 1.5mL EP 管中加入 100 μl 血清、血浆、唾液等液体样本,并加入 500 μl 溶液 DNA/RNA DirOut-A,漩涡混合30s。漩涡完毕后加入 100 μl 的 DNA/RNA DirOut-B 溶液,漩涡混合均匀,取 0.5 μl 的该溶液作为 DNA/RNA 模板,直接用于下游 PCR 等试验即可。
3. 从动物咀嚼过的沙包或拭孖中提取病毒 DNA/RNA剪切部分动物咀嚼过的沙包或拭孖放置到 1.5 ml EP 管中,并加入 500 μl 溶液 DNA/RNA DirOut-A,漩涡混合30s。漩涡完毕后加入 100 μl 的 DNA/RNA DirOut-B 溶液漩涡混合均匀,取 1 μl 的该溶液作为 DNA/RNA 模板,直接用于下游 PCR 等试验即可。6.png


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PCR 反应需要使用哪些试剂和设备?

试剂:
模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
设备:
PCR仪:用于控制反应温度,保证PCR反应时不同温度环节的严格控制;电泳槽:用于分离PCR扩增产物;核酸提取仪:从组织样本中全自动提取核酸。  这些试剂和设备在PCR分子生物学技术中均是,只有在有序齐全的基础上,才能进行PCR反应并得出准确结果。

PCR相关基础实验:

PCR反应基本步骤一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:

一、变性:

利用高温(145225603-145225608℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。

二、退火或称接合,复性:

在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。

三、延伸:

DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。

PCR反应条件优化:

1、变性温度和时间:

保证模板DNA解链是保证整个PCR扩增成功的关键。加热145225600~145225605°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间:

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。

3、延伸温度和时间:

一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。

4、循环数:

其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。

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